大鼠Robo4（Robo4）ELISA检测试剂盒检测原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被大鼠Robo4（Robo4）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠Robo4（Robo4）呈正相关。用酶标仪在4*0nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法

*.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，*000转离心*0分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。*000转离心*0分钟取上清。

*.  细胞上清液：*000转离心*0分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。*000转离心*0分钟取上清。

*.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

*.       酶标仪（4*0nm）

2.       高精度加样器及枪头：0.*-*0uL、2-20uL、20-200uL、200-*000uL

*.       **℃恒温箱

操作注意事项

*.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

*.  预处理后的样本无需稀释，直接取*0μL加样即可。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

*.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

名称

*6孔配置

48孔配置

备注

微孔酶标板

*2孔×8条

*2孔×4条

无

标准品（64 pg/mL）

0.6mL

0.6mL

按说明书进行稀释

标准品稀释液

6mL

*mL

无

样本稀释液

6mL

*mL

无

检测抗体-HRP

*0mL

*mL

无

20×洗涤缓冲液

2*mL

**mL

大鼠Robo4（Robo4）ELISA检测试剂盒按说明书进行稀释

底物A

6mL

*mL

无

底物B

6mL

*mL

无

终止液

6mL

*mL

无

封板膜

2张

2张

无

说明书

*份

*份

无

自封袋

*个

*个

无

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：64、*2、*6、8、4、2 pg/mL.

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按*：20稀释，即*份的20×洗涤缓冲液加**份的蒸馏水。

洗板方法

*.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置*min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板*次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液**0μL，浸泡*min，洗板*次。

操作步骤

*.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加；标准品孔各加不同浓度的标准品*0μL；

*.  待测样本孔先加待测样本*0μL，再加样本稀释液40μL；

4.  随后标准品孔和样本孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体*00μL，，用封板膜封住反应孔，**℃水浴锅或恒温箱温育60min。

*.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置*min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板*次（也可用洗板机洗板）。

6.  所有孔加入底物A、B各*0μL，**℃避光孵育**min。

*.  所有孔加入终止液*0μL，**min内，在4*0nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。


试剂盒性能

*.  准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.**00。

2.  灵敏度：zui低检测浓度小于*.0 pg/mL。

*.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4.  重复性：板内、板间变异系数均小于**%。

*.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  大鼠Robo4（Robo4）ELISA检测试剂盒有效期：6个月