RA-FLSs细胞代次低人关节炎成纤维样滑膜 "

原代培养及其操作步骤：
原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。
*.剪切组织 先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约*mm*大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2.消化分离 消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
*.培养 细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～*）×*0* cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，*％CO2，**℃静置培养。一般*～*d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量*／2的新培养液，继续培养2～*d后换液，一般*～*4d可以长满瓶壁，进行传代。
4.注意事项
（*）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。
（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
（*）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。
（4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。
（*）L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。
（6）静置培养：原代细胞在消化分离后，置于CO2培养箱的头24～48h (必要时*2h)内，应处于*静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。
（*）消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。
（8）其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子，如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用，但费用较高。" "

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细胞培养集锦(一个培养*00多种细胞人的经验总结)
一、消化与吹打
很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近*00种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的*篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。
许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论：
*)其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在**度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分*min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后**度消化。
2)什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可以尝试，准备*00%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要去尝试过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液（不要笑，这个是初养悬浮细胞的人常犯的错误，以为悬浮培养就是一个一个分开）。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的（比如Calu-*细胞），吹打不超过20次后（一般*0次即可），成小规模聚集（*0个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或者像有的同学那样吹打*h，等待单细胞悬液出现。
*)我常看到一个比较复杂的四步消化法，这个挺有意思，我也是*次听说，应该是网友自己发展出来的方法，很有参考价值。但我估计这个方法可能对付少数非常怪异的细胞才需要这么复杂的程序。我目前养过的近*00株细胞里面，还没遇到这么怪异的。比如Caco2其实是很好消化的细胞，不需要胰酶孵育即可，只是有点成片分布。不要以为成片分布是自己没养好，这个视细胞而定。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你越来越不好。
4)比较难消化的细胞（润洗方法*min还不能消化），就以colon cancer为例，比如HCT**, LS4**和KM*2，这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般*00 mm dish，一次最多加入*00ul，就足够了，一般我加*00ul。即使这样难消化的细胞，一般不超过*min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，但也只要用少量胰酶孵育，*min左右即可看到成片沙状移动。
*)常规的细胞实验（增殖，凋亡，迁移，分化之类的），受消化影响不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求极高。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降（当然也有其它因素影响包装效率）。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。
6)EDTA的作用。许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA联合作用。这里要明白，trypsin切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca离子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果*0min还消化不彻底的话），而应该想其它办法。
*)PBS洗涤。消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为Serum含有抑制trypsin的蛋白。但这里面也有学问可以讲，对于一些难消化细胞，那么可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制trypsin的活性。但对于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞，不需要配制如此溶液。
总结下来，虽然以上说的是关于消化的，但其实消化并不是细胞培养的关键所在（虽然很重要），关键所在是细胞来源，血清质量和水源（自己配制溶液的话）。我看到版上许多人养细胞遇到各种各样的问题，很多时候bottleneck没有找到，虽然通过其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因为人们往往注意自己的操作，总觉得自己没有经验，而忽视试剂，溶液尤其是细胞的质量，后者其实才是许多细胞培养实验室常见的问题。" "

细胞传代培养（消化法）标准操作规程
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
*. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS)
2. 胰酶-EDTA溶液(0.0*%胰酶-0.**mM EDTA-4Na): 以*0ml分装于** ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在**℃水槽回温。
*. 新鲜培养基
4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
*. 传代前准备
（*）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入**℃水浴锅内预热。
（2）用**％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（*）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
（*）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。
（6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（*）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
（8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶消化
（*）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞*，*消化温度是**℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（*）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
*. 吹打分散细胞
（*）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入*0ml离心管中。
（*）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以*000转/分钟离心6-8分钟。
（4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞
（*）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于*×*0*/ml。*要做好标记。
（2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～*个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
（*）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
*. 悬浮型细胞的传代
（*）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心*000 rpm * 分钟。
（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
注意事项：
*.严格的无菌操作。
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.02g，葡萄糖 2.00g，0.*％酚红4ml，加入蒸馏水定容至*000ml。*0磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到*.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。"