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传代细胞培养：原代细胞或细胞株或细胞系需在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的原代细胞或细胞株或细胞系或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续，这个过程体外培养称为传代细胞培养。一般认为，细胞培养形成单层汇合，细胞密度与生存空间有密切的关系，将培养细胞分散，以*:2或l:*或*:4以上的比率转移分散进行培养，即为传代细胞培养。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数/*00个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.*％，肿瘤细胞可达*～*％。细胞接种2～*天分裂增殖旺盛，是活力*时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
传代细胞的培养：（*）吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以2*mL培养瓶为例）。（2）每瓶加入2mL,无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉。（*）每瓶加入*mL消化液（0.2*%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2~*分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化。（4）加入完全培养基*mL，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。（*）用计数板计数，计算细胞的浓度，并用培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。
传代细胞的建系和维持
*、细胞档案：细胞档案要记录好，如组织来源、生物学特性（由形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有无支原体和潜存病毒等）、培养基的要求、传代换液时间、扩增时间（分裂指数），细胞的特殊遗传标志（标记染色体）等，这些记录对于保证细胞的正常生长，保持细胞的一致和经长期培养细胞特性的变异比较，都有十分重要的意义。
2、换液传代：（*）细胞系的传代、换液方法与前相同，但一般都有自身的规律性，因而在继续传代时，要注意保持其稳定的规律性，这样可以减少由于传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不规律而导致细胞生长特性的改变，给以后的实验带来影响。（2）多种细胞系维持传代，要严格操作程序，对所用的试剂各系不能交叉。每传*代后，细胞种子均应冻存。传代时均应作好记录，培养瓶上要有明显标记，标记细胞系名称和传代的代数及传代时间。细胞种子的及时冻存不仅可防止污染丢失，而且还可防止因盲目传代而造成细胞变异，此外还可提供不同代次的细胞同时进行对比试验。" "

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细胞培养中常见的污染情况总结
*、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理
2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，**度孵箱培养2-*天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－**%酒精擦洗－紫外灯照。预防霉菌污染，可在培养基里加*u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作。
*、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。
4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。
*、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），**度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长就是操作的问题。也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
*、孵箱应定期用三氧机消毒或者紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素
*、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染
4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。" "

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