一、常见实验异常与处理

扩增抑制问题

· 现象：样本扩增曲线异常（如H07样本抑制）。

· 处理：对样本进行稀释（建议1:5或1:10），降低抑制物浓度后再复检。

基线设置异常

· 现象：自动基线设置不合理导致曲线偏移。

· 处理：手动调整基线参数，将基线结束点设置为扩增信号出现的前一个循环（如原26改为20）。

无Ct值或信号缺失

排查方向：

· 检查PCR参数是否开启荧光信号采集。

· 验证模板完整性（避免反复冻融或降解）及引物/探针活性（通过PAGE电泳检测）。

· 排除设备休眠或电源干扰导致的中断。

异常扩增曲线

· 斜直线型曲线：检查分液均匀性（确保反应管液面一致）及反应管气密性（避免蒸发）。

· 末尾起跳曲线：

· 若阴性对照出现，提示污染风险（需彻底清洁操作台及耗材）。

· 若复检后仍存在，可能是低浓度样本的非特异性扩增。

二、关键操作规范

样本处理

· 使用无菌耗材，避免引入外源DNA污染（如气溶胶）。

· 高浓度样本需预稀释，减少抑制剂影响。

反应体系配置

· 严格按比例配制Mix，避免酶活性不足或引物过量。

· 分液后检查八连管液面高度一致性，减少孔间差异。

设备操作

· 上机前确认反应管密封性（按压管盖确保无缝隙）。

· 定期校准荧光阈值（建议每月一次），避免基线漂移。

三、污染控制策略

分区操作

· 严格划分试剂准备区、样本处理区、扩增区，避免交叉污染。

· 使用带滤芯枪头及专用实验服。

清洁与灭活

· 实验后使用10%次氯酸钠擦拭台面，紫外照射30分钟灭活残留核酸。

· 定期更换移液器滤芯及密封圈。

四、实验记录与复检

· 记录异常曲线特征及处理步骤，建立故障排查档案。

· 对可疑结果执行三次重复实验，排除偶然误差。