OCM-*A细胞系技术硬人低侵袭性脉络膜黑色素素瘤 "

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购买细胞注意事项：
*. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
*. 用**%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养过夜，隔天再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常，请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活力，请拍下照片及时和我们联系，信息确认后我们为您再免费寄送一次。
4. 建议客户收到细胞后前*天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和公司技术部沟通交流。
细胞传代操作步骤
一、贴壁细胞传代
*.提前将培养基、PBS放入**℃水浴锅内预热，用**%酒精擦拭后再放入超净台内。
2.吸除或倒掉细胞瓶内旧培养液，加少量PBS润洗细胞。
*.加入适量胰酶，使胰酶的量能盖住细胞，**℃孵育，每隔2~*min显微镜下观察，待贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时弃去胰酶，加入新鲜培养基，晃动细胞瓶，终止胰酶作用。
4.用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液。控制吹打的力度，避免产生大量的气泡。
*.将细胞悬液分别接种到另外的2~*个细胞瓶内，加入新鲜培养基，置**℃温箱培养，隔天观察贴壁生长情况。
二、悬浮细胞传代
*.将细胞悬液转移到无菌离心管内，*000rpm离心*min。
2.弃去上清，加入新鲜的培养基，用吸管小心吹散沉淀，制成细胞悬液。
*.将细胞悬液分别接种到另外的2~*个细胞瓶内，加入新鲜培养基，置**℃温箱培养。" "

细胞培养三不要：
养科研细胞是生物医学研究的基本功。有三个小经验可以和大家分享一下：
*. 不要烧瓶口。大多数人都喜欢在酒精灯的火焰上关瓶子，觉得这样可以避免污染。不知道大家是不是有培养基怎么越用越发紫的困惑？知道为什么吗？烧瓶口烧的。培养基一般都是用碳酸/碳酸氢跟作缓冲体系。瓶口在火焰上的时候，炽热的空气进入瓶内。塞紧塞子放入冰箱后，空气变冷，压力骤降，培养基中的碳酸就会转化成二氧化碳，释放出来。培养基中的碳酸少了，当然会变碱。如果不烧瓶口的话，你会发现培养液变碱的速度会大大减慢。（当然多多少少还是会有一点越用越碱，因为室温还是比冰箱内的温度高）
其实烧瓶口防止污染纯粹是心理安慰。不妨试一下把手指在火上晃几下，你会发现根本就不会烧疼。如果有细菌的话，这么晃两下也烧不死多少。要想烧死全部细菌，除非把瓶口和塞子烧红。我在国内从来就不烧瓶口。来美国以后发现这里更彻底，超净台内根本就不点酒精灯。
2. 不要频繁看细胞。对于初学者而言，养细胞就像养孩子一样，有空就要去看看。细胞越是养不好，就越是经常去看。实际上看细胞对细胞的生长没有任何好处，特别是对原代细胞或是免疫磁珠分选后，密度特别低的细胞。培养基中的生长因子是非常有限的。细胞好不容易自分泌一点儿促生长的因子在其周围，形成有利于生长的局部环境。你跑去看细胞，培养瓶这么一晃，把因子都给晃散了。经常可以看到新手一天到晚都在看细胞，细胞老是长不好。老手细胞一扔好几天不管，细胞疯长。
*. 不要怕消化。在传代的时候，初学者往往生怕细胞消化过度，早早地终止消化。细胞没下来就使劲吹灯，吹得满瓶子都是气泡。在我看来，用力吹打对细胞的损伤比消化更大。我师兄在做血管平滑肌原代的时候，**度消化过夜，细胞也没事。我一般是等细胞完全变圆后才中止消化。细胞轻轻一晃就能下来。还有，动作要轻柔，尽量不要产生气泡。气泡在破裂时的机械应力相当大，对细胞的伤害也是很大的。" "

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传代培养及其操作步骤：原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的*利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。
传代细胞培养操作步骤：（*）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。（2）向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。（*）置**℃孵箱或室温（2*℃温度）下进行消化，2-*min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。（4）吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。（*）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。（*）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2-*d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。
传代细胞培养注意事项：（*）掌握好细胞消化的时间，消化时间过短时，细胞不宜从瓶壁脱落，过长的消化会导致细胞脱落、损伤。（2）掌握好消化浓度，当消化液浓度过高时，消化时间应缩短，过低时细胞消化时间相对延长。
体内细胞培养及其操作步骤：瘤细胞悬液接种（*）无菌选取生长良好(有光泽，淡红色)瘤组织或对数生长期培养瘤细胞。（2）在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨，经80～*00目筛网过滤成细胞悬液。（*）培养细胞应用PBS洗两遍。（4）计数并调整细胞浓度至*0(*)～*0(8)/ml。（*）常规消毒后，于接种部位(通常为背部或腋窝腹股沟皮下)用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液(0.*ml/部位，＞*0(6)细胞)。初次接种成功率低，细胞数尽可能多一些。（6）次日注意观察动物一般情况。初次接种一般有一段较长的潜伏期，以后随着传代潜伏期逐渐缩短，*固定为一个相对稳定的时间。
腹水瘤的建立与腹水瘤的接种：将实体瘤细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤细胞，将这种腹水反复传代，即可成为腹水瘤。初次传代时，腹水常呈血性(含大量红细胞)，反复传代后腹水逐渐变成乳白色。腹水瘤的接种过程如下。（*）将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤，进行细胞计数。（2）消毒动物，左下腹穿刺接种*×*0(6)腹水瘤细胞。（*）接种腹水瘤细胞后约*-*2d，待小鼠腹部明显膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用*号针头抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽*-*ml。（4）抽取的腹水经*000rpm离心**min，收集上清，分装冻存备用。
培养细胞的冻存及复苏：细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-**6℃液氮中，储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
冻存细胞：（*）选对数增生期细胞(证明无支原体污染)，在冻存前*d换液。（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达*×*0(*)/ml左右密度，离心，去上清。（*）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO *ml，*.6%NaHCO* 0.*ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂*0％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，可使冰点降低，使细胞内水分在冻结前透出细胞外。（4）分装于无菌冻存管中，每管加*.*m悬液。（*）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标记。（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-*℃/min的速度，在*0～40min时间内，下降到液氮表面，再停*0min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。
复苏细胞：（*）从罐中取出冻存管。（2）迅速放入*6℃～**℃水浴，不时摇动，使其急速融化，*0～60s内完成。（*）冻存管用*0％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加*0ml培养液。（4）低速离心(*00～*000r/min) *min，去上清后再用培养液洗一次。（*）用培养液适当稀释后，装入培养瓶**℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。冻存细胞数量要充分，密度应达到*0(*)/ml，在融后稀释20倍时，仍能保持*×*0(*)/ml数量。"