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细胞传代培养（消化法）标准操作规程
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
*. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS)
2. 胰酶-EDTA溶液(0.0*%胰酶-0.**mM EDTA-4Na): 以*0ml分装于** ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在**℃水槽回温。
*. 新鲜培养基
4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
*. 传代前准备
（*）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入**℃水浴锅内预热。
（2）用**％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（*）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
（*）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。
（6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（*）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
（8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶消化
（*）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞*，*消化温度是**℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（*）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
*. 吹打分散细胞
（*）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入*0ml离心管中。
（*）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以*000转/分钟离心6-8分钟。
（4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞
（*）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于*×*0*/ml。*要做好标记。
（2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～*个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
（*）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
*. 悬浮型细胞的传代
（*）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心*000 rpm * 分钟。
（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
注意事项：
*.严格的无菌操作。
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.02g，葡萄糖 2.00g，0.*％酚红4ml，加入蒸馏水定容至*000ml。*0磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到*.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。" "

实验室细胞培养经验分享：
启蒙老师的重要性：一般进实验室都有师兄师姐带着做，他们就是你做细胞的启蒙老师。他们的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则，如营养液、细胞瓶的摆放位置；灭菌处理程序；开盖手法；细胞吹打手法等等。要学会他们的正确操作，在*次的时候就要重视。
像养孩子一样养细胞：细胞真的很脆弱，*每天都去看看它，以防止出现培养箱缺水、缺二氧化碳、停电、温度不够等异常现象，也好及时解决这些意外，避免重复实验带来的更大痛苦。
好细胞要及时保种：细胞要分批传代，这样即使有一批出了问题，还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。但这是我血的教训，有一次细胞污染了，全军覆没。当时可后悔没有保种。
每种细胞都有自己的特性，要区别对待：细胞跟人一样，不同的细胞，培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。
如我养的平滑肌细胞很活跃，喜欢热闹，2~*天就好多人口，而且不太爱吃喝，真是*养的孩子了。内皮细胞和平滑肌细胞性格相近，不过它很不讲卫生，也很邋遢，里面有很多分泌屋，要经常换洗才行。RAW264.*细胞也很开朗，而且很能吃，要经常喂它，头疼的是细胞很容易活化，培养它的瓶子和环境没有内毒素才好，不过我这个当妈的很难满足它了。
培养前的工作准备充分：包括耗材的处理、试剂的配置，无菌检验等等。
玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿（细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等）要先用洗衣粉刷干净（注意死角），然后冲干净。用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水冲洗 *0 遍，除去残留酸液。瓶子之类，冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡24h。晾干后包扎，*60℃干烤2h待用。
试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意pH值的调节。
无菌检验。主要采用过滤除菌：如胰酶、抗生素、G-4*8溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌：如PBS、D-Hank's等。
试剂分装保存：包括营养液、胰酶、血清等。
血清特别重要。血清必须贮存于–20℃，如果一次无法用完一瓶，可将40～*0ml分装于无菌酸处理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。一般厂商提供的血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。（一般情况下不影响细胞培养）" "

细胞培养方面注意的几点：
无菌意识要强：实验进行前，超净台以紫外灯照射*0分钟灭菌，以*0 % ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启超净工作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以*0 % ethanol擦拭无菌操作抬面。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置，其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以*0%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在*无菌区域，一般勿在边缘区域操作。
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 4*°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
选择正确的培养基：不同的细胞可能培养基不同，甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。如我当时培养神经干细胞，有文献就选用neurobase培养基，而我的实验目的主要是做抗氧化和氧化方面的，而这种培养基中含有抗氧化剂成分，此时，我就不得不选择另外一种不含抗氧化剂的培养基。
瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃冰箱全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至**℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
热灭活是指*6℃，*0分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到*6℃后，将血清放入，待温度升高到*6℃后计时，一般*分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。注意更换新血清（包括不同批次）对细胞的影响。"